中科院1区-南中医： 半夏泻心汤治疗结直肠癌的作用及机制—网络药bobapp官方下载入口理学方法

　　结直肠癌（CRC）是全球第三大最常见的恶性肿瘤，也是全球癌症相关死亡的第四大原因。CRC是一种涉及遗传、环境和生活方式风险因素的多因素疾病。铁在CRC的发病机制中起着重要作用，铁诱导的细胞凋亡或铁死亡（Ferroptosis）与肿瘤免疫微环境中的铁作用密切相关。半夏泻心汤（BXD）由七种天然药物组成，具有抗炎、免疫调节、抗癌和抗氧化作用。尽管已有临床和体外研究证实了BXD的抗CRC活性，但其活性成分及其分子机制尚不清楚。本研究采用网络药理学方法预测BXD对CRC的潜在机制，并结合体外和体内模型进一步确定作用机制。

　　采用高效液相色谱法对Bbobapp官方下载入口XD的六种主要化学成分进行鉴定(图1A)。这些组分的化学式如图1B所示。结果表明，该方法简便可靠，具有良好的线性关系，准确度、重复性和稳定性高，可用于有效地控制BXD的质量。对BXD中6种主要化学成分的含量测定表明.

　　通过网络药理学分析，共鉴定出符合筛选标准的生物活性化合物158个，预测出237个潜在靶点。通过19936个CRC靶点与1966个直肠癌靶点的交叉，共获得46个治疗靶点。基于这些数据，构建BXD复合目标网络并进行可视化(图2)。

　　首先做了CCK8实验，根据给药浓度的增加，细胞活性呈现出下降的趋势。不同浓度的药物作用于HCT116细胞时，BXD的IC50为304.5405 μg/ml(图4A)。根据这些数据，我们分别选择150、304和600 μg/ml作为低、中、高浓度进行后续实验。

　　EdU实验证实，BXD的主要成分能显著抑制HCT116和SW480细胞的体外增殖(图4B)。

　　伤口愈合和Transwell迁移实验证实，BXD成分可以显著降低体外HCT116细胞的迁移能力(图4C和D)。

　　铁检测结果显示，高浓度BXD主成分混合物处理后，HCT116细胞总铁水平显著升高(图5A)。处理后，HCT116和SW480细胞中的ROS水平也呈浓度依赖性增加(图5B)。

　　Western blot分析显示，BXD各组分可显著提高自噬标志物LC3 II(微管相关蛋白2轻链3 β)与LC3 I的比值，提高铁蛋白自噬标志物NCOA4的水平。BXD成分还降低了铁下垂标志物FTH1和GPX4的水平(图6A)。

　　电镜观察显示，随着BXD组分浓度的增加，HCT116细胞中自噬体的数量显著增加(图6B)。为了进一步探索其作用机制，我们使用western blot检测细胞内PI3K、AKT和mTOR及其磷酸化形式的水平。结果显示，BXD组分干预可以显著降低HCT116细胞中PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平(图6A)。我们使用AKT抑制剂(MK2206)和AKT激活剂(SC79)进一步验证BXD对HCT116和SW480细胞信号通路的影响。结果表明，与BXD组相比，AKT抑制剂可进一步提高LC3 II/LC3 I比率和NCOA4水平，降低FTH1和GPX4水平，增加铁和ROS水平，最终抑制细胞增殖。

　　7.BXD在体内抑制CRC皮下异种移植肿瘤的生长，增加肿瘤中铁和ROS的水平以及初步验证

　　采用HCT116细胞建立裸鼠CRC皮下异种移植瘤模型。结果显示，与对照组相比，BXD组皮下肿瘤的大小和重量明显减小，以高剂量组最为明显(图7A)。然后解剖肿瘤组织，测定铁含量。结果显示，BXD组肿瘤铁含量高于对照组，其中以BXD- h组升高最为显著(图7B)。ROS检测显示，BXD组的ROS水平显著高于对照组，其中以BXD- h组最为显著(图7C)。

　　此外，Ox对皮下移植瘤的抑制作用略强于BXD-H。Ox和BXD-H对肿瘤中铁和ROS水平的影响相当(图S6)。

　　Western blot分析结直肠癌肿瘤结果显示，与对照组相比，BXD组LC3II / LC3I和NCOA4水平升高，FTH1和GPX4水平降低。PI3K、AKT和mTOR的磷酸化也降低(图8)，这与体外实验数据一致。

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